淋巴细胞(精选5篇)

摘要

An experimental study of He- Ne laser irradiation on the macrophages and lymphocytes in lymph node 【Abstract】 Objective To research the effects of He-Ne laser irradiation on immunity of organism.Methods Shenque acupoints of mice abdomen…

淋巴细胞范文第1篇

【摘要】 目的 探讨弱激光对机体免疫刺激作用的机理。方法 用剂量63.7J/cm2的He-Ne激光照射小鼠神阙穴，照射时间为10天，每天照射5min，（1）采用台盼蓝活体注射显示巨噬细胞吞噬力试验方法；（2）采用吖啶橙（AO）显示核酸的荧光染色法分别观察小鼠肠系膜淋巴结内巨噬细胞的吞噬功能和淋巴细胞内核酸含量的影响。（3）观察淋巴结组织结构。结果 （1）照射组淋巴结内巨噬细胞吞噬功能较对照组显著增高，差异有非常显著性(P 0.01)；（2）照射组淋巴细胞内核酸含量较对照组明显增多。（3）淋巴小结增多增大。结论 适当剂量的He-Ne激光可激活淋巴结免疫功能，提高机体免疫力。

【关键词】 激光；巨噬细胞； 淋巴细胞

An experimental study of He- Ne laser irradiation on the macrophages and lymphocytes in lymph node

【Abstract】 Objective To research the effects of He-Ne laser irradiation on immunity of organism.Methods Shenque acupoints of mice abdomen were irradiated by He-Ne laser at the dosages of 63.7J/cm2 for 10 days，5 minutes each day.Then following methods are taken：(1)Observing the phagocytosis of the macrophages in lymph node after trypan blue injecting the live mice.(2)Observing the changes of nucleic acid of lymphocytes with fluorescence microscope.(3) Observing the tissue structure of lymph node by HE stain.Results The four indexes：number of trypan granule，area of granule，ratio of granule area to cell area and granule integral optical density at irradiated group were higher than that of non-irradiated group (P 0.01).The nucleic acid of irradiated groups were higher than non-irradiated group.In addition.the lymphoid nodule in the irradiated groups remarkable changes indicating their activation. Conclusion He-Ne laser at appropriated dosages may activate lymph node and enhance the immunity of organism.

【Key words】 laser;macrophage; lymphocyte

淋巴结是机体的主要周围淋巴器官，位于淋巴循环的通路上，其大小、结构及内含细胞成分的变化与机体的免疫功能状态密切相关。本文采用He-Ne激光照射小鼠神阙穴后，观察激光对肠系膜淋巴结组织结构和其内巨噬细胞吞噬力及淋巴细胞增殖能力的影响。旨在探讨低强度激光对机体免疫刺激作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 昆明种小白鼠，体重18~22g，雌雄各半，随机分成对照组和照射组，采用上海产1000B(c)He-Ne激光器照射小鼠神阙穴（剪毛），照射功率25mW，照射剂量为63.7J/cm2，光斑直径0.3cm，照射时间为10天，每天照射5min。

1.2 方法 （1）取材前3日，每天往腹腔内注射0.5%的无菌台盼蓝0.3ml，第4日取肠系膜淋巴结。用10%福尔马林固定，常规法制成石蜡切片，用伊红淡然，将切片用HI-CI型医学图像分析系统于每组600倍光镜下随机选择12屏，统计巨噬细胞吞噬台盼蓝的颗粒数目(GN)、颗粒面积(GA)及其与细胞面积之比(GA/CA)和颗粒积分光密度(IOD) 4项指标，并输入微机作F检验。（2）取肠系膜淋巴结涂片，用Carnoy 氏固定液固定15min，再用0.01% AO缓冲液染色10min，置OLYMPUS BHF-型荧光显微镜的高倍镜下观察，DNA呈黄色荧光，RNA呈红色荧光，DNA或RNA含量越多，黄色或红色越深越亮。（3）常规HE染色方法观察淋巴结的组织结构。

2 结果

2.1 He-Ne激光对淋巴结巨噬细胞吞噬能力的影响 淋巴结的每组切片置图像分析系统的光镜下放大600倍，随机选择12屏观察淋巴结髓质区，巨噬细胞胞质内出现蓝色颗粒为阳性，台盼蓝颗粒呈大小、粗细不等，分布不均，颜色深浅各异。图像分析结果用统计软件作F检验，见表1。

表1 He-Ne激光照射对淋巴结巨噬细胞吞噬功能的图像分析结果 (x±s，n=30)

注：照射10天组与对照组比较，*P 0.01

结果表明：照射组的巨噬细胞吞噬台盼蓝的颗粒数目、颗粒面积、颗粒面积与细胞面积之比和颗粒的积分光密度四项指标均较对照组增高，差异有非常显著性(P 0.01)。

2.2 He-Ne激光对淋巴细胞内核酸的影响 活性染料AO同时显示两种核酸，在荧光镜下 DNA呈黄色荧光，RNA呈红色荧光，随核酸含量的增加，颜色加深变亮。本实验结果显示：照射组淋巴细胞内黄色和红色较对照组明显的加深、变亮。说明照射组淋巴细胞中两种核酸含量较对照组增多。同时可见许多增殖分化形成的浆细胞。

2.3 He-Ne激光对淋巴结组织结构的影响 本实验用光镜观察淋巴结实质结构，与对照组比较照射组的淋巴结内淋巴小结多而大，生发中心明显，高内皮微静脉变大。髓索内可见浆细胞。

3 讨论

淋巴结的大小、结构及内含细胞成分的变化与机体的免疫功能状态密切相关。淋巴结受不同的抗原刺激可发生不同的应答变化，各种结构相对增大或缩小，并与疾病相关。淋巴结的巨噬细胞在负责清除淋巴液中的抗原物质的同时处理抗原，并提呈给T淋巴细胞，T淋巴细胞增殖，引发细胞免疫。B细胞接触抗原后，在Th细胞的辅助下增殖分化，导致淋巴小结增多增大，髓索中浆细胞增多，引发体液免疫［1］。

低能量的He-Ne激光已在临床广泛的应用，并取得了显著的治疗效果［2］。尤其对免疫性疾病疗效更佳［3］。有关作用机制的研究已有很多报道［4，5］。神阙穴（脐中央）位于经络上，具有运行气血，沟通上下表里，调节脏腑机能。我们采用He-Ne激光照射小鼠神阙穴后，从组织、细胞和分子水平观察了He-Ne激光对淋巴结的影响，结果显示：(1)与对照组比较，照射组的淋巴结中淋巴小结明显增多、增大，在淋巴索中可见浆细胞，高内皮微静脉变大。说明He-Ne激光照射可增强体液免疫，促进淋巴细胞再循环。(2)各照射组GN、GA、GA/CA 及IOD四项指标均较对照组显著增高。(3)照射组淋巴结的淋巴细胞DNA和RNA含量明显增多，同时观察到B淋巴细胞分化为浆细胞及其各种过渡状态的细胞。DNA是生物遗传的物质基础，遗传信息通过DNA转录成RNA，再由RNA翻译成特定的蛋白质，通过蛋白质执行各种生命的功能［6］。B淋巴细胞活化后进行增殖分化形成浆细胞。提示He-Ne激光可激活淋巴结内免疫细胞。增强巨噬细胞吞噬功能，促进淋巴细胞增殖分化能力，特别是B淋巴细胞增殖分化浆细胞，促进淋巴细胞再循环，提高机体的免疫功能。

【参考文献】

1 成令忠.现代组织学.上海：上海科学技术文献出版社，2003，640.

2 Jing Chen，Dai Chengxiang，Liu Ruiyun，et al.Low dosage HeNe laser irradiated in blood vessel to treat 60 patients with coronary artery disease.Chinese Journal of Physical Therapy，1997，20(3)：89-90 (in Chinese)

3 安雅民.氦氖激光治疗感染伤口疗效观察.中华理疗杂志，1991，14（1）：26-27.

4 高美华，李武修，冯献启，等.激光照射对荷瘤小鼠淋巴细胞活性的影响.中国激光，2002，29（4）：381-382.

淋巴细胞范文第2篇

噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH）属于组织细胞增生症的第Ⅱ类，占巨噬细胞相关疾病的绝大部分。本文综述近年HLH的临床实验研究和诊断治疗策略，并概述其生物学、免疫学和病理生理学特征。

hLH包括二个难以彼此区分的亚型。（1）原发性HLH：即家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（FHL，FHLH或FEL）。（2）继发性HLH：即感染相关性噬血细胞综合症（IAHS或VAHS）和恶性相关性噬血细胞综合症（MAHS）[1。

1 发病率和流行病学

儿童原发性HLH（FHL）的年发病率约为0.12/10万。世界各地均有报道。FHL属常染色体隐性遗传，大多数发病年龄很小，中位发病年龄为2.9个月[2]。一份报道涉及至少2个成员发病的9个家，有4个家族发病均＜6个月。父母近亲婚配占24％，阳性家族史占49％。

继发性HLH的确切发病率尚不得而知。从1979至1995年，文献中已报道219例从新生儿至18岁的LAHS，一半上以来自日本、中国和台湾[3]。半数年龄＜3岁。13％存在与免疫缺陷或免疫抑制治疗有关的原发疾病。IAHS的触发因子以EB病毒最多见，EB病毒相关HLH存在明显的免疫学失衡和预后不良[4]；其他病毒包括人疱疹病毒6型[5]、巨细胞病毒、腺病毒、细小病毒、水痘一带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒、Q热病毒和麻疹病毒及细胞、真菌、原虫等。

2 症状和体征

fHL自然过程的典型表现为间断或持续发热、肝脾显著肿大和血细胞减少，不少病人伴有进行性脑和脑膜症状。热型呈波动性和迁延性，也可自行消退，少数可发生在病程的后期。肝脾肿大往往显著并呈进行性发展。皮疹疹型无特异性，呈一过性，常与高热并行。仅有半数可见淋巴结肿大。CNS受累多发生在病程的晚期，症状包括易激惹、前囟膨出、颈项强直、张力减低或增高和惊厥等。颅神经麻痹（第6、7对）、共济失调、偏瘫／四肢麻痹、失明和意识丧失以及非特异性颅内压增高亦有发生[6]。

肺部症状可继发于淋巴细胞和巨噬细胞的聚集，有时难于和感染鉴别。其他还有苍白、食欲减低、黄疸、浮肿和生长迟缓等非特异性症状。血小析减少时可出现紫癜和出血。中位存活期约2个月。

iAHS临床表现基本同FHL。常有淋巴结肿大，特别见于EB病毒感染。有报道73％HLH患者在确诊时存在CNS受累[7]。

3 实验室检查

fHL外周血以血小板减少和贫血最多见，血小板计数的变化可能预示疾病的活动程度。白细胞减少较轻微。高三酸甘油脂血症常见于早期伴有发热的全身性疾病。脂蛋白电泳常可发现极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白明显增高，密度脂蛋白减低。肝功异常可表现血清转氨酶增高或胆红质增高。铁蛋白升高、低钠血症和总蛋白／白蛋白比率减低亦较常见。疾病的活动期常见低纤维蛋白原血症，凝血酶原时间延长，活化部分凝血活酶时间可能延长。

脑脊液检查可见淋巴细胞增多（5~50×10-6/L），伴蛋白增高。单核细胞可见，但噬血细胞少见。有时即使有脑炎表现，脑脊液也可正常。

影象学检查，肺部X线常可见中度间质浸润。MR和CT可发现脑部病变，代表炎症或肿髓鞘。也可发现出血、萎缩和脑水肿。

iAHS实验室检查与FHL类似，但应做病毒学或其他感染因子的检测。血清铁蛋白有时可超过100000 ng/ml。

4 病理、病理生理和免疫学

hLH的主要组织学所见是在网状内皮系统里呈混合的淋巴组织细胞堆积。组织细胞呈现活化，确诊时有阳性噬血细胞者约占75％。被吞噬细胞主要为红细胞，偶见血小析和白细胞。最易受累的器官为脾、肝、淋巴结、骨髓和CNS[8]。组织学和细胞学所见均无特异性，诊断必须依赖临床和实验室结果的综合考虑。骨髓内未发现噬血细胞不能排除HLH。少数病例骨髓中可见大的颗粒状淋巴细胞，胞体延长形如马尾或蝌蚪状，可能代表HLH的特殊类型[9]。

多数小儿FHL的早期阶段，骨髓呈中度增生，缺乏任何典型特点，噬血细胞并不常见，与临床表现的严重性不相平行。晚期可见细胞减少，易误诊为再生障碍性贫血或骨髓低增生性疾病。

脾脏呈红髓扩张伴大量单核细胞浸润，可见非常活跃的噬血细胞。淋巴结内特别在T细胞区内可见组织细胞堆积，淋巴窦受累和扩张，在T区常见噬血细胞，滤泡减少和缩小，有时缺如。多数病人淋巴结中淋巴细胞减少。

在肝门胆管区可发现大量淋巴细胞和少数组织细胞浸润，这种组织学所见类似于成人的慢性活动性肝炎，婴儿见此改变，有力地支持FHL诊断。

多数病例可见CNS外观水肿，进展型病例可见组织的软化和破坏。镜下所见脑膜有淋巴细胞和巨噬细胞浸润或广泛性组织浸润和多病灶坏死，软脑膜最常见噬血细胞增多。

hLH的免疫系统紊乱表现了T细胞功能缺陷，T细胞和单核细胞活性增强，高细胞因子血症和选择性细胞毒活性缺乏。NK细胞和T细胞细胞毒活性减低或缺乏，以FHL患儿减低明显且持续时间长，而缃发性HLH病人仅在起病时减低，晚期则恢复正常，原因可能与基因缺陷有关[10]。

高细胞因子血症是构成HLH病理生理的重要内容之一。常见有下列细胞因子增高：IL－1受体拮抗因子[11]、可溶性IL－2受体（sIL－2r）、IL－6[12]、γ干扰素（INF－γ）、肿瘤坏死因子（TNF）和新蝶呤（neopterin）。FHL的临床和实验室发现与炎症性细胞因子所诱发的生物学变化极其相似。见于FHL的高三酸甘油脂血症和脂蛋白酯酶受抑实际上是脂多糖类扩发以后净化TNF的关键。骨髓的衰竭状态也很可能是由于细胞因子作用的结果。由于病人循环中INF－γ和sIL－2r也有增高，淋巴细胞也可能在病理生理中起重要作用。可以认为T淋巴细胞的调节功能减弱可能是HLH的主要原因。Kaneko等[13]对9例HLH做了外周血核型检查，其中6例有异常克隆细胞的病人均因病情进展而死亡，提示本病包括恶性因素。

5 诊断和鉴别诊断

由于缺乏特异性实验室诊断方法，诊断HLH有时非常困难[2]，因而误诊和漏诊者多。有人估计约一半FHL病人未能确诊。为方便诊断，特建立以上指导原则。

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（1）临床标准

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×发热

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×脾肿大

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（2）实验室标准

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×血细胞减少（外周血2系或3系减少）

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血红蛋白＜90g/L

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血小板＜100×109/L

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中性粒细胞＜1.0×109/L

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×高三酸甘油酯血症和／或低纤维蛋白原血症（禁食后三酸甘油脂）≥

2.0mmo/L或≥相应年龄正常值的3SD），纤维蛋白原≤1.5g／L或≤3SD）

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（3）组织学标准

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×骨髓、脾脏或淋巴结中可见噬血细胞但无恶性表现

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hLH的诊断需要满足上述5条标准，发热、血细胞减少（2系以上）、脾肿大、高三酸甘油脂血症和／或低纤维蛋白原血症以及出现噬血细胞。血清铁蛋白和乳酸脱氢酶增高也提示HLH诊断[14]。FHL的诊断尚需依赖阳性家族史或近新婚配。应当指出，有些病例的表现与上述标准并非完全一致，一些不典型的表现可能反映出本病的多基因缺陷。新生儿起病或以脑膜受累为主者发热可不明显，血细胞减少、高三酸甘油脂血症以及低纤维蛋白原血症也往往与内脏受累的程度有关。起病时脾大常不显著。此外，起病时并非总能找到噬血细胞。连续做骨髓检查可能有助于诊断。也可考虑从其他器官获得标本，应用细针对脾脏抽吸活检常能找到噬血细胞；肝脏的组织学所见如类似于慢性持续性肝炎亦支持HLH的诊断。脑脊液中如见单个核细胞增多亦支持HLH。所有病人均应在起病时和骨髓移植前进行NK细胞活性检查。

hLH应与多处疾病进行鉴别。但最为棘手的是原发性和继发性的鉴别。虽然病毒感染常见于VAHS，但也可见于FHL的起病阶段。因此，病毒感染的存在并不能只考虑VAHS。此外FHL属隐性遗传，家族史阴性也不能排除本病。

发病年龄小于1~2岁提示FHL的可能性大。如年龄＞8岁，则提示可能有其它原发病，2~8岁起病者，须依赖上述诊断标准审慎考虑。对继发性HLH检查其血清细胞因子类型、EBV染色体组和史隆性确定可能有助于诊断[15]，如诊断仍难以确定，可考虑按FHL治疗。

此外，继发性HLH还见于某些恶性疾病，称为MAHS，年长儿发病时更应与此病鉴别。小儿ALL和纵膈精原细胞瘤合并噬血细胞综合症并非少见。还有淋巴瘤相关性噬血细胞综合症（LAHS）特别是EB病毒相关性LAHS有时会误诊为VAHS，临床应予注意。

6 治疗和预后

（1）FHL的治疗，应用长春花碱加皮质激素疗效较好。鬼臼乙叉甙（VP－16）或鬼臼噻酚甙（VM－2）加皮质激素可取得长期缓解。一种包括VP16·地塞米松（Dex）·鞘注甲氨蝶呤（MTX）和颅脑照射的治疗方案可取得缓解和长时存活。免疫治疗最近被引起注意，应用环孢菌素A（CSA）对FHL有效。抗胸腺细胞球蛋白（ATG）也可使病情缓解。

1994年组织细胞协会推荐出通用方案（HLH－94）用于治疗FHL。采用CSA、Dex和VP16相结合。具体包括：在8周VP16（150mg/m2）和Dex(10mg/m2·d，3周后减量)治疗后，如有合适的供者，可进行异基因BMT；对无条件进行BMT的FHL以及非家族性HLH难治或复发病例，均继续应用VP16、Dex和CSA（6mg/kg·d口服），疗程1年，由于Dex可穿透血脑屏障，故对有CNS受累的病人，应首选包括Dex在内的全身治疗并鞘注MTX。有时在缺乏任何特异性标志的情况下，如临床充分怀疑FHL，也可开始治疗以避免病情进展和不可逆的功能损害。

在病情稳定状态下进行异基因BMT是FHL的选择性治疗方法[16－19]。接受HLA匹配同胞骨髓的BMT最为有效。常用预处理方案包括VP16、马利兰和环磷酰胺。接受无关供者的骨髓移植应去除供者的T细胞。已观察到部分植入也可取得长期缓解。病人体内存在少量的供者细胞即可防止HLH复发。BMT排斥后仍可使病人维持18个月以上的临床缓解。

（2）非家族性HLH的治疗：也可采用HLH－94方案。目的在于抑制淋巴细胞和巨噬细胞的活化。如在开始治疗8周后完全治愈，可终止治疗。如存在病毒感染应采用抗病毒治疗。对在免疫抑制治疗下出现的HLH，应终止原治疗。以前对VAHS曾主张避免化疗，但最近发现，病人存在病毒感染并不能除FHL。很多EB病毒感染相关性病例仅在使用化疗后才使病情得到控制，故对未证实为家族性疾病的HLH，不管有无病毒感染均应进行化疗。应用皮质激素和鬼臼类毒素，可使存活期明显延长[20]。Janka等[3]报道，82例HLH，经免疫化疗后4年的无病存活率为57.2％，其中＜2岁的小年龄组预后略差。对NK细胞活性减低或缺乏的病人应进行BMT治疗。 参考文献

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2 Aric M ，Janks G， fischer A， et al .Leukemia，1996;10(2):197

3 janka G，Imashuku s，Elinder G，et al.Hematol/Oncol Clin North Am，1998;12(2):435

4 imashuku S，Hibi S， tabata S，et al，Med Pediartr Oncol，1998;31(3):358

5 hoang MP，Dawson dB，Rogers ZR，et al .Hum Pathol，1998;29(10):1074

6 henter JI，Nennesmo i，J Pediatr ，1997;130(3):358

7 haddad E，Sulis mL，Jabado N，et al ..Blood，1997;89(3):794

8 ost A，Nilsson aS，Henter JI，Histopathology，1998;32(4):310

9 imashuku S，Hibi s，Morinaga S，et al .Br J Haematol，1997;96(4):708

10 sullivan KE，Delaat cA，Douglas SD，et al.Pediatr Rds，1998;4494):465

11 imashkuk S，Hibi s，Fujiwara F，et al .Br J Haematol，1996;93(4):803

12 henter JI，Andersson b，Elinder G，et al .Med Pediatr Oncol，1996;27(1):21

13 kaneko Y，aseki n，Sakurai M，et al .Br J Haematol，1995;90(1):48

14 imashuku S，Hibi S， todo S，et al.J Pediatr ，1997;130(3):352

15 imashuku s，Int J hematol，1997;66(2):135

16 Baker KS，Delaat cA，Steinbuch M，et al，Blood，1997;89(10):3587

17 Bolme P，Henter jI，Winiarski J，et al .Bone Marrow Transplant，1995;15(3):331

18 golins P，Watts m，Brocklesby M，et al .Br J Haematol，1997;96(3):644

淋巴细胞范文第3篇

关键词：针吸细胞学；颈部淋巴结；细胞块

中图分类号：R730.49 文献标识码：A

Abstract：Objective Stduy on the characteristics of fine needle aspiration biopsy of cervical lymph nodes. Methods Confirmed by postoperative histopathology， cytology characteristics were retrospectively analyzed by 135 cases of cervical lymph node. Results The similarity between Cell block and corresponding histologic；The concordance rate between the cytologic and corresponding histologic diagnoses was 98.52%（133/135）. Conclusion Fine needle aspiration biopsy of cervical lymph node carries a high diagnostic accuracy， To make cell block is necessary to our work.

Key words：Fine needle aspiration cytology；Cervical lymph node；Cell block

颈部淋巴结肿大是临床常见疾病，是多种疾病的共同表现，细针吸取细胞学（fine needle aspiration cytology，FNAC）快捷、经济、损伤小、准确率较高，笔者对本院及旌阳区中医院2014年1月～2015年10月135例颈部淋巴结肿大患者行FNAC检查，同时与活检对照，分析FNAC细胞块形态特点。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集本院及旌阳区中医院2014年1月～2015年10月淋巴结穿刺患者135例（本院100例和中医院35例），其中颈侧淋巴结94例，锁骨上淋巴结41例，均获术后组织病理学证实，男性75例，女性60例，年龄17～84岁。

1.2方法 患者取坐位或卧位，充分暴露颈部，局部碘伏消毒，左手固定肿块并绷紧皮肤，右手持10ml注射器（7号针头）刺入肿块，保持注射器持续负压约2～4ml抽吸2～3次，穿刺过程中可改变方向多点穿刺，穿刺结束解除负压迅速拔出针头，压迫止血5min，将穿刺针放置约5min，待针筒内穿出物稍凝固后用4%中性甲醛涮洗出来固定4h（是用于细胞块的制备）、常规全自动标本脱水处理机脱水、透明、浸蜡后包埋、切片、常规HE染色。由两位有细胞病理学诊断经验的医生根据显微镜下细胞块特点做出细胞学报告。

2 结果

2.1细胞学检查结果 135例颈部淋巴结针吸细胞学中，炎性疾病76例，淋巴结肿瘤59例。炎性疾病包括慢性淋巴结炎35例、化脓性淋巴结炎26例、坏死性淋巴结炎15例；淋巴结肿瘤包括转移癌48例（见图1、2）、非霍奇金淋巴瘤9例，霍奇金淋巴瘤2例。

2.2针吸细胞学与组织学检查结果对照 135例颈部淋巴结针吸细胞学检查中，与组织学对照正确133例，正确率为98.52%（133/135）。

3 讨论

FNAC检查是常用的快捷、损伤小、经济、可靠的体表肿块诊断技术，孙海斌报道颈部580例淋巴结针吸细胞学准确率为94.4%[1]，本文总结135例颈部肿大淋巴结FNAC，准确率为98.52%，略高于文献报告，可能是由于我们在穿刺过程中同时制备细胞涂片与细胞块的缘故。穿刺操作过程中会有不同程度出血，而大量出血会稀释标本干扰涂片制备质量，细胞块制作的原理是红细胞凝固将肿瘤细胞包裹，可以弥补涂片中细胞量不足对诊断的影响，细胞块切片背景清晰、细胞聚集、可连续切片且与组织学形态更相似，在细胞块基础上可作细胞免疫化学及分子检测。

颈部淋巴结针吸细胞学镜下形态特点：①慢性淋巴结炎：显示多种形态的细胞群，包括小淋巴细胞、滤泡中心细胞、巨噬细胞等，但以成熟淋巴细胞和淋巴母细胞为主；②化脓性淋巴结炎：由中性粒细胞、单核巨噬细胞、细胞碎片构成；③坏死性淋巴结炎（符合结核）：干酪样坏死物质之间查见组织细胞、上皮样细胞及多核巨细胞，利用新鲜的穿刺标本作荧光定量聚合酶链反应在诊断淋巴结结核中较抗酸染色法更加准确、快速、阳性率更高[2]；④淋巴结转移性角化性鳞状细胞癌：细胞涂片显示胞浆丰富红染的上皮细胞团，核圆形、椭圆形，大小不等重叠，核膜不光滑，核染色质深呈墨水滴样；细胞块显示红细胞包裹着呈巢的上皮细胞团，同细胞涂片比较细胞块可见巢中央的角化珠形成；⑤淋巴结转移性非角化性鳞状细胞癌：细胞涂片中细胞成分极少，细胞块中可见红细胞包裹的癌巢及成熟的脂肪细胞，肿瘤细胞呈合体样，具有泡状核及明显的核仁， 18例颈部淋巴结非角化性鳞状细胞癌经术后组织病理学证实为鼻咽癌转移，患者颈部肿大淋巴结部位均为胸锁乳突肌处颈深淋巴结，该部位是鼻咽癌转移的好发部位，这与文献报道一致[3]；⑥淋巴结转移性小细胞癌：细胞涂片上由小圆形、瓜子型瘤细胞构成，瘤细胞约2个成熟淋巴细胞大小，呈弥漫排列，瘤细胞胞质极少，核深染呈椒盐状[4]；细胞块示密集的小圆形、短梭形瘤细胞呈巢片状排列，染色质细，未见明显核仁。注意小细胞癌与淋巴瘤的鉴别，可在细胞块基本上做Syn、CD56、LCA等免疫标记；⑦非霍奇金淋巴瘤：由圆形或卵圆形、大小一致的幼稚淋巴细胞组成，肿瘤细胞染色质细，核膜厚，可见明显核仁及核分裂；⑧霍奇金淋巴瘤：成熟淋巴细胞背景中查见Reed-Sternber细胞，核仁明显约为成熟淋巴细胞大小，仔细查找背景中可见散在嗜酸性粒细胞。

FNAC具有简便，准确，快速的特点，我们在为患者作颈部淋巴结针吸细胞学检查时尽可能的制备细胞块并严格准确掌握其形态特点，将提高颈部淋巴结针吸细胞学诊断的准确性，对临床原发病灶的查找也可起到提示作用。

参考文献：

[1]孙海斌，郑晓芙，张剑.颈部淋巴结针吸细胞学580例诊断分析[J].中华病理学杂志，2008，37（10）：693-697.

[2]余小琴，方雪松.细针吸取细胞学联合荧光定量聚合酶链反应在诊断淋巴结结核中的作用[J].中华结核和呼吸杂志，2009，32（1）：51-54.

淋巴细胞范文第4篇

【关键词】 T淋巴细胞生物杀伤 细胞毒性

细胞介导的免疫效应在机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫、移植排斥效应和自身免疫性疾病发生机制中发挥重要作用， 主要效应细胞之一为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphoclyte， CTL)。近年来， 基于CTL特异性表位的多肽疫苗已经成为研究热点之一， CTL的活化及对靶细胞的杀伤效应成为衡量疫苗质量的重要因素之一。目前已经报道许多新的评价CTL活性及其杀伤效应的方法， 现就此做一综述。

1 单个细胞水平测定CTL活性

目前一般常用的有产生细胞因子的细胞记数法和有限稀释分析法(LDA)。活化的T淋巴细胞可分泌一些功能性的细胞因子， 如IL2、IFNγ、TNFα等， 由于分泌不同种类细胞因子可以区分不同免疫功能的记忆细胞或效应细胞， 这样可以在体外评价外周血单个核细胞（PBMC）中抗原特异性T细胞的数量和功能状态。目前常用的检测细胞因子的方法如ELISA、ELISPOT、PCR/RTPCR及细胞内因子检测等。

1.1 有限稀释分析法(Limiting dilution analysis， LDA) 该方法是迄今应用较广泛的定量分析系统［1］。LDA 法使我们能够详细了解免疫反应动力学和记忆CTL(Memory CTL， mCTL) 细胞亚群的细胞周期［2］， 也是对pCTL和mCTL亚群细胞表面的激活标志物进行研究的良好方法。但此方法也存在缺点， 主要是: (1)在LDA条件下， 深入刺激会使效应CTL(eCTL)细胞加快凋亡［3］， 使CTL活性测定值变动较大， 对eCTL细胞数量不能测定或测定值偏低。(2)实验较繁琐， 因为在实验之前， 首先需要将淋巴细胞表面表达的CD分子， 如CD44或CD62L进行染色， 再用FACS法分类筛选， 然后在LDA条件下培养6 d; 这样就会造成T细胞数量损失， 特别是在活化状态进行筛选和分离时。

1.2 ELISA ELISA可直接检测肿瘤患者体液如血液中的细胞因子(如IL2、IFNγ或TNFα)水平， 也可用于测定激活的淋巴细胞(诸如LAK或CIK细胞) 培养液中各细胞因子水平， 这是评估免疫活性细胞激活程度和免疫状态的重要指标。当然， ELISA法检测的是一群细胞产生的细胞因子总量， 无法给出单一细胞的信息和精确估算抗原特异性T细胞数量， 而且， 它不能检测淋巴细胞被抗原刺激后产生细胞因子的能力。在肿瘤免疫检测中， 随着ELISPOT技术的发展， ELISA法的应用已逐渐减少。

1.3 固相酶联斑点法( Enzymelinked immunospot， ELISPOT) 基于酶联免疫标记技术的基本原理建立的ELISPOT技术不仅灵敏度大为提高， 而且能得到分泌细胞因子的细胞频数。CTL受抗原刺激后一旦分泌功能性细胞因子， 就被预包被的抗体直接捕获， 通过局部形成的斑点数目得出分泌细胞因子的T细胞频数， 从而反映抗原特异性CTL的活性。此法的优点在于: (1)激活的T细胞周围环境中细胞因子高度浓集， 即使只分泌100个因子的细胞， 也能被检测出来， 敏感性很高; (2)使用的2种单克隆抗体一般识别同一种因子的2个不同表位， 特异性很高; (3)可对T细胞直接进行检测， 不需要体外扩增， 所需的T细胞量较少， 应用冻存的PBMC可以反复检测多种细胞因子; (4)在检测细胞数量的同时也可反映其功能， 与临床结果相关性较好。但是ELISPOT法也有一些缺点: 检测到的T细胞必须能分泌目标细胞因子， 如果T细胞无功能或分泌其他的细胞因子， 就有可能低估抗原特异性细胞的数量; 除了CTL， 一些辅助T淋巴细胞(CD3+和CD4+)、自然杀伤细胞等也可分泌相同的细胞因子， 故还需结合细胞表型的分析， 为解决这一问题， 目前已经有同时检测两种细胞因子的方法［4］。

Malyguine等［5］比较了分别对GrB(颗粒酶B) ELISPOT法、IFNγ ELISPOT法和51Cr释放法进行了比较， 实验结果显示三者的相关性较好， 并指出检测GrB ELISPOT法与51Cr释放法的反应性非常接近， 而比IFNγ ELISPOT法和四聚体法更快速更直接。ELISPOT法所需细胞少， 鉴定抗原表位效率很高。另外基于IFNγ或TNFγ分泌性CD8+T细胞的ELISPOT法已用于检测几种MHCⅠ类分子限制性黑色素瘤抗原， 如MAGE、gp100、Mart1、酪氨酸酶等［6］。缺点是大数量的斑点， 或者斑点的形状变异较大而导致人工分析变得很困难。如果应用计算机辅助成像检测技术即可解决此问题， 还能够确定分析斑点的面积， 分析T淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。

1.4 染色细胞内的细胞因子 体外培养、刺激、活化细胞， 用Brefeldin A封闭细胞因子分泌途径， 使细胞因子在细胞内累积。然后， 用荧光或生物素标记的CD4+或CD8+的mAb对细胞进行CD4或CD8表面标志物染色， 再经去污剂固定并增高细胞通透性， 使抗细胞因子荧光抗体结合到细胞内［7］。最近已经建立了CD4+T细胞和CD8+T细胞的抗原特异性细胞因子分泌细胞的细胞内染色方法。此方法应用细胞内累积细胞因子的染色和多种颜色参数的FACS法， 是检测人循环淋巴细胞中抗原特异性T淋巴细胞的可行方法。

1.5 基因水平的检测 通过PCR、RTPCR或荧光定量PCR可以对细胞因子的DNA或RNA进行检测， 这是检测一种或多种目标基因转录水平的较为准确的分子生物学方法。Kruse等［8］曾用荧光定量RTPCR 法分析了冷冻保存的正常人血标本中的细胞因子mRNA 水平， 许多肿瘤免疫的临床试验中， 也都应用了该法作为检测免疫反应的指标。定量RTPCR可确定抗原特异性T细胞的数目， 而且不需要任何体外刺激步骤， 是目前最敏感的细胞因子检测技术。

2 MHC肽四聚体法 (solubleMHCpeptide tetramer)

人们对MHCⅠ类分子与小分子多肽的共价结合复合物(MHCⅠpep)的制备及其与TcRαβ的识别与结合的研究已经取得了长足的进步， 从而出现了一种崭新的技术: MHCⅠ类分子抗原肽(MHCⅠpep)四聚体法。以往认为， 如果缺乏抗原持续刺激， CD8+T细胞的记忆寿命将较为短暂， 而四聚体法研究结果却发现并非如此， 在无抗原刺激的情况下， 有一定数量的mCTL可长期存在。但同时也揭示了CD8+T细胞记忆的固有限制性， 认为淋巴组织中的抗原特异性CD8+T细胞对特异抗原的刺激再反应需要时间， 然后还要将它们从淋巴组织向非淋巴组织集中。该法克服了51Cr释放法， LDA等方法的局限性， 可以应用于各种抗原特异性CTLs的表型分析和分离［9］， 也可以用来检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞反应。它的主要优点是: 检测得到的T细胞数量比常规方法要高10倍［10］， 这是因为MHC肽四聚体的结合仅仅需要合适的TCR表达， 可以检测到所有的特异性T细胞， 不管是祖细胞还是效应细胞， 也不管有无功能; 其次， MHC肽四聚体标记的T细胞可以通过表面标记分析或功能分析(如胞内细胞因子检测)进一步定性， 也可以通过流式细胞术或MHC多肽多聚体包被的珠粒对特异性T细胞进行收集、纯化和克隆［11］， 避免了体外刺激的多个循环步骤。但是， 该法也存在一些限制: (1)感兴趣的肽段必须装配于四聚体中， 所以肽段必须是已合成的， 因此只限于检测已经确定的T细胞表位; (2)由于MHC多肽四聚体定量T细胞的敏感性极高， 无法确定标记的T细胞是否有功能; (3)可靠性受到标本制备的限制， 有时T细胞克隆不被染色［12］， 且T细胞活化所需的TCR亲和力和四聚体染色所需的亲和力之间的关系目前还不很清楚; (4)尽管Ⅱ型MHC肽四聚体曾被描述过， 传统上只有Ⅰ型MHC肽四聚体可以广泛应用。

迄今为止， MHCⅠpep四聚体法已被用于研究病毒性感染及肿瘤等疾病， 如HIV、EBV、HTLV、HCMV及白血病等的研究。此方法的出现可以说是对细胞免疫研究的里程碑， 存在的问题主要是: 每个四聚体均需针对特定的MHCⅠ类分子而设计， 而且以免疫球蛋白为连接物的方法亦有极大应用潜力， 但目前研究中应用并不广泛。目前， 在美国NIH已经有专门的研究开发小组对此方法的各方面进行进一步发展， 以期方法和试剂能够适用于该领域的各种情况。

3 CTL杀伤效应的检测

3.1 51Cr释放法 20世纪60年代末建立的51Cr释放法是测定CTL功能最经典方法。该法结果准确、重复性好， 但存在以下不足: (1)51Cr有放射性， 不利于安全操作及废物处置， 而且自发释放率高， 半衰期短(27.8 d) ， 无法用于需多次测定的动物试验; (2)不是定量分析， 操作步骤多而细胞共育时间短， 不能在单细胞水平进行测定， 但有研究者同时运用ELISPOT法和51Cr释放法进行检测［13］; (3)从效应细胞角度而言， 由于从外周血中直接得到的效应细胞很少， 需进行多次体外刺激， 可能会导致T细胞的组成及活性与体内状态不同［14］; 从靶细胞方面考虑， 由于自体肿瘤很难得到， 不得不经常使用一些替代靶细胞， 如HLA配型相同的异源肿瘤细胞系或可负载目标抗原的细胞， 实验结果可能不会反映体内CTL细胞的真实活性［15］; (4)与临床结果相关性存在一些问题， 有研究表明， CTL 活性低的患者在临床上反而出现了肿瘤缩小。另外， 建立该方法时还没有CTL表位被鉴定， 对细胞的体外刺激采用全抗原， 不存在表位肽体外刺激的问题。随着抗原表位的大量鉴定， 目前通常要求鉴定抗原表位特异性CTL应答， 实验中经常遇到的问题是表位肽特异的CTL杀伤活性的检测通常不太敏感， 郭波等的研究［16］表明: 存在的游离多肽可显著降低表位特异性的CTL对靶细胞的杀伤效应， 影响杀伤的敏感性， 另外通过FicollHypaque离心， 将死细胞从活细胞中去除， 或加入IL2可以提高杀伤的敏感性。

3.2 LDH释放法 细胞胞质中富含乳酸脱氢酶， 正常情况下不能通过细胞膜， 当细胞受损或死亡时可释放到细胞外， 所以细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比， 用比色法测定实验孔LDH 活性， 并与靶细胞对照孔进行比较， 可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率［17］。LDH释放法的优点在于自然释放率低， 无需预标靶细胞， 避免同位素掺入法的不稳定性和放射性污染， 而且排除了形态观察法的主观差异性， 具有大量样本快速检测的优点。但是LDH是细胞本身生长代谢的产物， 可能存在自发释放现象， 而且效应细胞作用于靶细胞后也会有不同程度的损伤， 同样会释放LDH， 这些都会影响细胞毒活性检测的精确性， 另外较高浓度的胎牛血清中所含的LDH 可能会干扰结果。

3.3 报告基因转染法 应用基因转染技术将原核或真核生物的报告酶如β半乳糖普酶(βgalactosidase， βgal)或荧光素酶(luciferase， luc)基因转染靶细胞， 建立稳定转染靶细胞系， 以此测定CTL介导的细胞毒和细胞凋亡。通过测定释放入培养液中报告酶活性(代表靶细胞死亡数目)， 可以计算效应细胞杀伤靶细胞百分率。其中βgal半衰期较luc长， 应用较为方便。本法优点在于: （1）灵敏度高， 自发释放背景低; （2）用不同报告基因转染的细胞系可同时测定杀伤效应， 结果互不干扰， 还可通过转基因小鼠进行在体CTL活性研究; （3）用不同的基因调控元件(如组织特异性的或活性可诱导的启动子)控制报告基因的表达， 可进一步深入进行机制研究。其主要不足是建立报告基因稳定转染细胞系费时费力; 报告基因在有些靶细胞难以转染或表达。

3.4 荧光测定法 荧光测定法测定CTL活性是近年来发展的。它包括alamarBlue一步荧光测定法、alceinAM荧光扫描测定法、PEmAb/FITCannexin V 荧光标记法、DIOC18(3)/碘化丙锭（PI）荧光标记法和PKH26/CFSE荧光标记法等。这些测定所基于的原理都与51Cr释放实验基本相同: 将标记物质渗入到靶细胞内， CTL杀伤靶细胞后， 检测这些物质释放到培养基内的水平。不同的是alamarBlue为活细胞代谢指示剂， 易溶于水， 进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化， 可用以定量; Calcein acetoxymethy1酯（CalceinAM）是一种胞浆荧光标记物， 本身无荧光， 渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。荧光测定法仍面临两个问题: （1）虽然随着荧光测定仪器的普及和新的荧光标记物的发现， 荧光测定法将有可能取代传统的51Cr释放法， 但由于荧光测定法基于的原理近似于51Cr释放法， 所以都不能从本质上解决不同靶细胞标记效率不同、CTL杀伤活性的检测不够敏感等问题; （2）其他的非基于51Cr释放法的检测， 则由于只能反映CTL是否活化， 而不能反应这些活化的CTL是否有杀伤功能。事实上， 有证据已经提示， 在某些慢性感染和恶性肿瘤中， 虽然有CTL的活化， 但没有杀伤活性［16］。

总之， 以上介绍的关于CTL生物杀伤效应的测定方法各有特点， 目前应用较多的肿瘤免疫CTL检测方法中， 51Cr释放法被认为是评价抗原特异性CTL 反应的金标准， 但该法无法检测不具增殖潜能的T细胞前体; ELISPOT能更准确地反映T细胞在体内的情况， 但仍依赖一定时间的肽诱导以产生细胞因子， 会低估总的特异性CTL数量， 不过敏感度远高于51Cr释放法; MHC肽复合物多聚体染色法， 是目前最新的直接检测特异性CTLs的方法， 可以直接对T 细胞染色， 还可结合流式细胞术（FCM）计数细胞， 敏感性大大增强， 又不受基因型的限制。有一些实验对肿瘤免疫检测的各种方法结果相关性进行了比较， Tan等［18］在研究EBV 相关抗原特异性CD8+细胞数目时， 发现MHC肽四聚体染色的结果是ELISPOT的414倍， 是51Cr释放法的513倍; Whiteside 等［19］在对8名转移性黑色素瘤患者进行免疫治疗时发现， 四聚体染色检测所得的特异性CD8+细胞数目最多， FCM次之， 最少的是ELISPOT ， 而且三种方法之间无明显相关性。产生这种结果的原因可能是， 四聚体与T细胞结合只需要T细胞表达TCR即可， 而ELISPOT则要求T 细胞有功能。总之， 免疫学检测结果与临床疗效之间的关系比较复杂， 到目前为止还没有完全摸清二者之间的相关性。

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淋巴细胞范文第5篇

【关键词】嗜血细胞综合征；淋巴瘤相关；NK/T细胞性；成人

【中图分类号】R-0 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2015）03-0284-01

1临床资料

患者女，44岁，以“发现右腋下肿物半月”为主诉于2014年8月28日入院，完善相关检查，全身浅表淋巴结彩超示双颌下、双颈外侧区、双锁骨上下、双腋窝、双腹股沟等多处淋巴结肿大，于2014年9月2日在全麻下行腋窝淋巴结切除活检术，术后根据病理检查报告确诊（左腋窝）NK/T细胞性非霍奇金氏淋巴瘤。于2014年9月5日转入血液肿瘤科进一步治疗。入科时，患者一般情况较差，生命体征不平稳，低热多汗，精神萎靡，进食水差、乏力、下床困难。专科查体：S：1.46O，kps：60分，左腋窝4cm手术切口愈合可，双颈部、双腋窝多处可扪及多枚淋巴结肿大，以右腋窝明显，最大约3.0×3.0cm，质地中，活动度尚可，边界清，无压痛及溃烂，双侧扁桃体Ⅰ度肿大，牙龈有出血，双肺呼吸音粗，未闻及湿罗音，心（-），肝肋下触及二指，脾肋下触及三指，肝脾肾区无压痛，双手指关节及双下肢多处见红斑形成，无关节痛及肿大，双下肢无水肿，病理征阴性。入科后患者反复发热，体温最高达39.5℃，降温等对症处理效果欠佳，病情进展快，于2014年9月8日意识恶化，呈浅昏迷状态，巩膜及皮肤黄染，右肺闻及较多湿罗音。患者病情凶险，化疗能够逆转病情的可能性小，随时可能出现重度感染、大出血、休克等危及生命，积极与家属交代病情，家属签字同意给予抢救性化疗，患者于2014年9月10日经CHOP方案抢救性化疗1程及对症支持治疗后，病情明显好转，意识恢复，生命体征平稳。患者于2014年9月18日出院，但预后差。

2相关检查

入科时实验室检查：血常规示白细胞（WBC）79.4×109/L，红细胞（RBC）3.3×1012/L，血小板（PLT）72×109/L，血红蛋白（HGB）97g/L，原始幼稚细胞16%，淋巴细胞30%，酸性粒细胞2%，中性粒细胞52%。免疫功能示自然杀伤细胞计数（NK）49708×106/L。凝血功能示部分凝血酶原时间25s，凝血酶原时间15.4s，凝血酶原活动54.1%，纤维蛋白原（Fbg）0.88g/L。肝肾功能示谷草转氨酶129U/L，乳酸脱氢酶2250U/L，谷丙转氨酶30.7U/L，谷氨酰胺转肽酶85.4U/L，总蛋白59.58g/L，白蛋白39.34g/L，总胆红素169.5μmol/L，尿素11.41mmol/L，尿酸682.3μmol/L。C反应蛋白23.92mg/L。降钙素原检测+血清蛋白电泳（自动）+血脂8项：甘油三酯（TG）3.6mmol/L，超敏C反应蛋白24.3mg/L。TOBCH检测弓形虫-IgM-、风疹病毒- IgM-、巨细胞病毒-IgM-、单纯疱疹病毒1- IgM-、单纯疱疹病毒2- IgM-。类风湿因子-，抗链球菌溶血素“O”-。

腹部彩超示肝脾大、腹膜后淋巴结肿大。心脏彩超示主动脉瓣轻度返流，左心舒张功能减退。鼻咽部、头颅MR示鼻咽、口咽壁及鼻咽顶后壁增厚，扁桃体增大，双侧咽旁及颈鞘区、颌下、腮腺区多发淋巴结肿大，左侧颞顶叶少许缺血灶。胸部正位DR示双肺内散在较多斑片状影，双肺门影浓密。骨髓检查示原始幼稚淋巴细胞比例增高，占22.5%，见少量吞噬细胞。

患者入院后血常规血细胞计数进行性减少，其他生化指标也显示出患者病情持续恶化。

3诊断和治疗

根据患者临床症状和检查结果，明确诊断为：1.（左腋窝）非霍奇金氏淋巴瘤 NK/T细胞性 IVEB（骨髓）IPI高危 2.急性淋巴细胞白血病3.嗜血细胞综合征4.肺部感染。患者的不适症状均与肿瘤及HLH相关，积极支持对症后未见明显好转。患者意识障碍伴感染、黄染、高热等，仅仅给予支持治疗不能阻止疾病进展，随时可能有生命危险，若化疗亦可能损害脏器功能，逆转病情可能性小。充分的医患沟通取得家属签字同意的前提下，结合淋巴瘤、ALL、HLH等治疗策略，选择给予基本化疗方案CHOP方案抢救性化疗1程，加强保肝、止吐、抑酸、水化、营养及维持水盐电解质平衡等支持治疗。化疗第3天，患者一般情况明显好转，意识恢复，临床症状改善。

4讨论

HLH是一种少见的综合征，分为原发性和继发性。继发性HLH分为感染相关、肿瘤相关、风湿病相关等。在肿瘤中淋巴瘤相关HLH以T和NK/T细胞淋巴瘤为多数[1]。本例即为NK/T细胞性非霍奇金氏淋巴瘤。该患者长期发热、肝脾肿大、高甘油三酯血症、低纤维蛋白原血症、≥2系血细胞计数进行性减少、骨髓见吞噬细胞、血中NK细胞明显增高、皮肤红斑、意识障碍等临床症状及实验室检查，符合国际组织细胞协会确定的诊断指南[2]。同时排除其他相关因素可能性，明确诊断为淋巴瘤相关的HLH。

淋巴瘤相关性HLH没有满意的治疗方案，Shin等[3]报道CHOP方案治疗有效。针对本例患者，选择CHOP化疗方案进行抢救性治疗，短期疗效显著。

该例为中年患者，临床及实验室检验指标变化迅速而典型，病情凶险，淋巴瘤相关性HLH较为少见，故应引起临床工作者的关注和研究。

参考文献

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